圓葉山烏龜繁殖

一种山乌龟的离体快速繁殖方法

技术 领域

[0001] 本发明涉及一种植物快速繁殖方法，尤其是山乌龟的离体快速繁殖方法，属于 植物栽培技术领域。

背景技术

[0002] 山乌龟是我国传统中药，主要分布于我国云南、贵州、四川等地。由于其肉质 块根古雅、奇特，果实玲珑，叶色清秀，植株外形别致可爱，因此，除了用作药材外， 还可作为极具观赏价值的盆栽植物，或者园林、绿化用植物。山乌龟植物最具药用价值 的是其硕大的根块，其成分中富含生物碱，随着新分离技术和高灵敏检测仪器的出现， 大量的生物碱被分离出来，含量高达3%〜4%，在临床上被广泛用于抗菌消炎、镇静、 理气止痛等，同时山乌龟根块是颅痛定的主要生产原料。随着山乌龟的药用价值和观赏 价值被不断发掘，市场对山乌龟的需求时也逐渐加大。然而由于山乌龟为雌雄异株，且 种子小，种壳坚硬，在自然条件下萌发较为困难，因此繁殖能力极差，加上近年来受人 为造成的环境因素影响，使山乌龟的种群及个体数量急剧减少。仅通过传统的播种、分 块的方法，远不能满足日益增长的市场需求。因此，需要研发出新的成本低、时间短、 成活率高的无性繁殖体系，以扩大山乌龟繁殖量，实现山乌龟的产业化生产。

发明内容

[0003] 本发明的目的在于提供一种山乌龟的组织培养与快速繁殖方法，以建立山乌龟 种群，扩大山乌龟繁殖量，提高增殖率及生根率，为山乌龟的规模化、产业化生产提供 优质种苗。

[0004] 为实现上述目的，本发明提供这样一种山乌龟的离体快速繁殖方法，其特征在 于经过以下工艺步骤：

[0005] A、选择体积硕大、形状优美、芽眼较多的山乌龟块根，栽种于室内珍珠岩中 至长出新梢，并切下该新梢作为外植体，去掉叶片，切成2〜3cm长的茎段，用常规的 加有适量洗涤剂的水清洗茎段，再用清水洗净，用质量浓度为0.1%的升汞溶液消毒1〜 4min,用无菌水漂洗3〜4次，得无菌茎段；

[0006] B、将A步骤的无菌茎段接种于下列诱导培养基中：

[0007] MS培养基

[0008] 6-苄胺基嘌呤（6-BA) 0.5 〜1.0mg/L

[0009] 2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D) O 〜0.05mg/L

[0010]萘乙酸（NAA) O 〜0.05mg/L

[0011]琼脂 6.5g/L

[0012]白糖 30g/L

[0013] pH 值 5.8 〜6.0

[0014] 在培养温度为22〜28°C，光照强度为1500〜2000Lx，光照时间为8〜12h/d的条件下，诱导培养16〜30天，在茎段基部萌发出1〜4个不定芽；

[0015] C、将B步骤的不定芽切下，接于下列增殖培养基中：

[0016] MS培 养基

[0017] 6-苄胺基嘌呤（6-BA) 1.0 〜2.0mg/L

[0018] 2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D) 0.02 〜0.04mg/L

[0019]萘乙酸（NAA) 0.02 〜0.04mg/L

[0020]琼脂 6.5g/L

[0021]白糖 30g/L

[0022] pH 值 5.8 〜6.0

[0023] 在培养温度为22〜28°C，光照强度为2000〜2500Lx，光照时间为8〜12h/d 的条件下，增殖培养20〜25天，每个不定芽新增殖1〜9个增殖芽，切下新增的高度为 2〜5cm的增殖芽，接种在新的与本步骤相同的增殖培养基中，按本步骤相同的培养条件 继续增殖培养，如此继代培养至获得足够量的增殖芽；

[0024] D、将C步骤的增殖芽按节切成2〜3cm长的茎段，接种在下列继代培养中：

[0025] 3-吲哚丁酸（IBA) 0.1 〜0.3mg/L

[0026]萘乙酸（NAA) 0.1 〜0.3mg/L

[0027]琼脂 6.5g/L

[0028]白糖 30g/L

[0029] pH 值 5.8 〜6.0

[0030] 在与C步骤相同的培养条件下进行壮苗培养，得健壮、带叶的丛生苗；

[0031] E、将D步骤的丛生苗分成单株，接入下列生根培养基中：

[0032] 1/2MS 培养基

[0033] 6-苄胺基嘌呤（6-BA) 0 〜0.2mg/L

[0034] 3-吲哚丁酸（IBA) 0 〜1.0mg/L

[0035]萘乙酸（NAA) O 〜l.Omg/L

[0036]琼脂 7.0g/L

[0037]白糖 30g/L

[0038] pH 值 5.8 〜6.0

[0039] 在培养温度为22〜28°C，光照强度为2000〜2500Lx，光照时间为8〜12h/d 的条件下，培养15〜20天，得生根苗；

[0040] F、将E步骤的生根苗在室外散射光下锻炼5〜7天，取苗，用清水洗净苗上 培养基，放入0.1%多菌灵溶液中消毒1〜2分钟，移栽至装有红土：河沙：珍珠岩= 1:1: 1质量比基质的育苗袋中，并在基质表面撒上适量腐殖土，按常规浇水、施肥、 病虫害防治管理，成活率达85%以上，当苗长至3〜5cm高，并生出大量须根时，即得 到种植苗。

[0041] 本发明具有下列优点和效果：

[0042] 1、采用上述方案，可对山乌龟的茎段进行快速增殖，同时保持和固定了山乌龟 块根硕大、高产、形状奇特等优良种性，从而在保证药用需求的同时，又能满足观赏价 值的特殊需求；[0043] 2、种苗来源单一，易于控制，解决了常规种子繁育体系很难将山乌龟优良性状 固定或保持下来的难题，有效地提高了种苗质量；

[0044] 3、能有效缩短生产周期，繁殖速度快，20〜25d为一个周期，繁殖倍数达1〜 9，易于优质种苗的规模化、标准化和工厂化生产；

[0045] 4、利用组织培养技术在培养室内实现周年生产，节约了土地资源，提高了经济 效益，克服了种苗无法周年进行生产的难点；

[0046] 5、本发明对山乌龟种苗生产技术流程中的关键环节进行优化整合，采取低激素 配比、激素混用和轮用的方式，达到提高增殖率和减少变异的目的，所生产的增殖苗和 生根苗，苗株健壮、节间短而粗壮、叶色浓绿，质量优，移栽成活率高达85%以上；

[0047] 6、无菌生根苗直接移栽进入育苗袋中，省去了组培苗营养钵移栽的环节，移栽 成活的种苗便于运输，摘去育苗袋后即可直接栽种。

具体实施方式

[0048] 为了更好地说明本发明的实质内容，下面结合本发明的实施例，但本发明的内 容并不仅限于这些。

[0049] 实施例1

[0050] A、选择体积硕大、形状优美、芽眼较多的山乌龟块根，栽种于室内珍珠岩中至 长出新梢，并切下该新梢作为外植体，去掉叶片，切成2〜3cm长的茎段，用常规的加有 适量洗涤剂的水清洗茎段，再用清水洗净，用质量浓度为0.1%的升汞溶液消毒lmin，用 无菌水漂洗3次，得无菌茎段；

[0051] B、将A步骤的无菌茎段接种于下列诱导培养基中：

[0052] MS培养基

[0053] 6-苄胺基嘌呤（6-BA) 0.5mg/L

[0054]琼脂 6.5g/L

[0055]白糖 30g/L

[0056] pH 值 5.8

[0057] 在培养温度为22°C，光照强度为1500Lx，光照时间为12h/d的条件下，诱导培 养16天，在茎段基部萌发出个不定芽，最少的发出一个芽，最多的发出四个芽；

[0058] C、将B步骤的不定芽切下，接于下列增殖培养基中：

[0059] MS培养基

[0060] 6-苄胺基嘌呤（6-BA) 1.0mg/L

[0061] 2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D) 0.02mg/L

[0062]萘乙酸（NAA) 0.02mg/L

[0063]琼脂 6.5g/L

[0064]白糖 30g/L

[0065] pH 值 5.8

[0066] 在培养温度为22°C，光照强度为2000Lx，光照时间为12h/d的条件下，增殖培 养20天，每个不定芽又新增出增殖芽，最少的增殖一个芽，最多的增殖九个芽，切下新 增的高度为2〜5cm的增殖芽，接种在新的与本步骤相同的增殖培养基中，按本步骤相同的培养条件继续增殖培养，如此继代培养至获得足够量的增殖芽；

[0067] D、将C步骤的增殖芽按节切成2〜3cm长的茎段，接种在下列继代培养基中：

[0073] 在与C步骤相同的培养条件下进行壮苗培养，得健壮、带叶的丛生苗；

[0074] E、将D步骤的丛生苗分成单株，接入下列生根培养基中，芽苗过高的，可切下 长2〜3cm的苗尖转接至下列生根培养基中，余下的基部返回接种到C步骤的增殖培养 基中，继续进行增殖培养，所述生根培养基为：

[0075] 1/2MS 培养基

[0076]琼脂 7.0g/L

[0077]白糖 30g/L

[0078] pH 值 5.8

[0079] 在培养温度为22°C，光照强度为2000Lx，光照时间为12h/d的条件下，培养15

天，得生根苗；

[0080] F、将E步骤的生根苗在室外散射光下锻炼5天，取苗，用清水洗净苗上培养 基，放入0.1%多菌灵溶液中消毒1分钟，移栽至装有红土：河沙：珍珠岩=1 ： 1 ： 1 质量比基质的育苗袋中，并在基质表面撒上适量腐殖土，按常规浇水、施肥、病虫害防 治管理，成活率达85%以上，当苗长至3〜5cm高，并生出大量须根时，即得到直接种 植在大田中的种植苗。

[0081] 实施例2

[0082] A、选择体积硕大、形状优美特别、芽眼较多的山乌龟块根，栽种于室内珍珠 岩中至长出新梢，并切下该新梢作为外植体，去掉叶片，切成2〜3cm长的茎段，用常 规的加有适量洗涤剂的水清洗茎段，再用清水洗净，用质量浓度为0.1%的升汞溶液消毒 4min,用无菌水漂洗4次，得无菌茎段；

[0083] B、将A步骤的无菌茎段接种于下列诱导培养基中：

[0084] MS培养基

[0085] 6-苄胺基嘌呤（6-BA) 1.0mg/L

[0086] 2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D) 0.05mg/L

[0087]萘乙酸（NAA) 0.05mg/L

[0088]琼脂 6.5g/L

[0089]白糖 30g/L

[0090] pH 值 6.0

[0091] 在培养温度为28°C，光照强度为2000Lx，光照时间为8h/d的条件下，诱导培养 30天，在茎段基部萌发出不定芽，最少的一个芽，最多的四个芽；

[0092] C、将B步骤的不定芽切下，接于下列增殖培养基中：

[0093] MS培养基

[0068] 3-吲哚丁酸（IBA)

[0069]萘乙酸（NAA)

O.lmg/L O.lmg/L

[0070] 琼脂

[0071] 白糖

[0072] pH 值

6.5g/L 30g/L 5.8

7[0094] 6-苄胺基嘌呤（6-BA) 2.0mg/L

[0095] 2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D) 0.04mg/L

[0096]萘乙酸（NAA) 0.04mg/L

[0097]琼脂 6.5g/L

[0098]白糖 30g/L

[0099] pH 值 6.0

[0100] 在培养温度为28°C，光照强度为2500Lx，光照时间为8h/d的条件下，增殖培 养25天，每个不定芽新增出增殖芽，最少的一个芽，最多的九个芽，切下新增的高度为 2〜5cm的增殖芽，接种在新的与本步骤相同的增殖培养基中，按本步骤相同的培养条件 继续增殖培养，如此继代培养至获得足够量的增殖芽；

[0101] D、将C步骤的增殖芽按节切成2〜3cm长的茎段，接种在下列继代培养中：

[0102] 3-吲哚丁酸（IBA) 0.3mg/L

[0103]萘乙酸（NAA) 0.3mg/L

[0104]琼脂 6.5g/L

[0105]白糖 30g/L

[0106] pH 值 6.0

[0107] 在与C步骤相同的培养条件下进行壮苗培养，得健壮、带叶的丛生苗；

[0108] E、将D步骤的丛生苗分成单株，接入下列生根培养基中，芽苗过高的，可切下 长2〜3cm的苗尖转接至下列生根培养基中，余下的基部返回接种到C步骤的增殖培养 基中，继续进行增殖培养，所述生根培养基为：

[0109] 1/2MS 培养基

[0110] 6-苄胺基嘌呤（6-BA) 0.2mg/L

[0111] 3-吲哚丁酸（IBA) 1.0mg/L

[0112]萘乙酸（NAA) l.Omg/L

[0113]琼脂 7.0g/L

[0114]白糖 30g/L

[0115] pH 值 6.0

[0116] 在培养温度为28°C，光照强度为2500Lx，光照时间为8h/d的条件下，培养20

天，得生根苗；

[0117] F、将E步骤的生根苗在室外散射光下锻炼7天，取苗，用清水洗净苗上培养 基，放入0.1%多菌灵溶液中消毒2分钟，移栽至装有红土：河沙：珍珠岩=1 ： 1 ： 1 质量比基质的育苗袋中，并在基质表面撒上适量腐殖土，按常规浇水、施肥、病虫害防 治管理，成活率达85%以上，当苗长至3〜5cm高，并生出大量须根时，即得到直接种 植在大田中的种植苗。

[0118] 实施例3

[0119] A、选择体积硕大、形状优美奇特、芽眼较多的山乌龟块根，栽种于室内珍珠 岩中至长出新梢，并切下该新梢作为外植体，去掉叶片，切成2〜3cm长的茎段，用常 规的加有适量洗涤剂的水清洗茎段，再用清水洗净，用质量浓度为0.1%的升汞溶液消毒 2min,用无菌水漂洗3次，得无菌茎段；0120] B、将A步骤的无菌茎段接种于下列诱导培养基中：

0121] MS培养基

0122] 6-苄胺基嘌呤（6-BA) 0.8mg/L

0123]萘乙酸（NAA) 0.03mg/L

0124]琼脂 6.5g/L

0125]白糖 30g/L

0126] pH 值 5.9

0127] 在培养温度为25°C，光照强度为1800Lx，光照时间为10h/d的条件下，诱导培 养22天，在茎段基部萌发出不定芽，少的为一个芽，多的为四个芽；

0128] C、将B步骤的不定芽切下，接于下列增殖培养基中：

0129] MS培养基

0130] 6-苄胺基嘌呤（6-BA) 1.5mg/L

0131] 2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D) 0.03mg/L

0132]萘乙酸（NAA) 0.03mg/L

0133]琼脂 6.5g/L

0134]白糖 30g/L

0135] pH 值 5.9

0136] 在培养温度为25°C，光照强度为2200Lx，光照时间为10h/d的条件下，增殖培 养22天，每个不定芽新增出增殖芽。最少的为一个芽，最多的为九个芽，切下新增的高 度为2〜5cm的增殖芽，接种在新的与本步骤相同的增殖培养基中，按本步骤相同的培养 条件继续增殖培养，如此继代培养至获得足够量的增殖芽；

[0137] D、将C步骤的增殖芽按节切成2〜3cm长的茎段，接种在下列继代培养中：

[0138] 3-吲哚丁酸（IBA) 0.2mg/L

[0139]萘乙酸（NAA) 0.2mg/L

[0140]琼脂 6.5g/L

[0141]白糖 30g/L

[0142] pH 值 5.9

[0143] 在与C步骤相同的培养条件下进行壮苗培养，得健壮、带叶的丛生苗；

[0144] E、将D步骤的丛生苗分成单株，接入下列生根培养基中，芽苗过高的，可切下 长2〜3cm的苗尖转接至下列生根培养基中，余下的基部返回接种到C步骤的增殖培养 基中，继续进行增殖培养，所述生根培养基为：

[0145] 1/2MS 培养基

[0146] 6-苄胺基嘌呤（6-BA) 0.1mg/L

[0147] 3-吲哚丁酸（IBA) 0.5mg/L

[0148]琼脂 7.0g/L

[0149]白糖 30g/L

[0150] pH 值 5.9

[0151] 在培养温度为25°C，光照强度为2300Lx，光照时间为10h/d的条件下，培养18

天，得生根苗；[0152] F、将E步骤的生根苗在室外散射光下锻炼6天，取苗，用清水洗净苗上培养 基，放入0.1%多菌灵溶液中消毒1分钟，移栽至装有红土：河沙：珍珠岩=1 ： 1 ： 1 质量比基质的育苗袋中，并在基质表面撒上适量腐殖土，按常规浇水、施肥、病虫害防 治管理，成活率达85%以上，当苗长至3〜5cm高，并生出大量须根时，即得到直接种 植在大田中的种植苗。

[0153] 实施例4

[0154] A、选择体积硕大、形状优美、芽眼较多的山乌龟块根，栽种于室内珍珠岩中至 长出新梢，并切下该新梢作为外植体，去掉叶片，切成2〜3cm长的茎段，用常规的加有 适量洗涤剂的水清洗茎段，再用清水洗净，用质量浓度为0.1%的升汞溶液消毒3min，用 无菌水漂洗4次，得无菌茎段；

0155] B、将A步骤的无菌茎段接种于下列诱导培养基中：

0156] MS培养基

0157] 6-苄胺基嘌呤（6-BA) 0.6mg/L

0158] 2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D) 0.02mg/L

0159]琼脂 6.5g/L

0160]白糖 30g/L

0161] pH 值 5.8

0162] 在培养温度为26°C，光照强度为1800Lx，光照时间为9h/d的条件下，诱导培养 20天，在茎段基部萌发出不定芽，最少的一个芽，最多的四个芽；

0163] C、将B步骤的不定芽切下，接于下列增殖培养基中：

0164] MS培养基

0165] 6-苄胺基嘌呤（6-BA) 2.0mg/L

0166] 2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D) 0.02mg/L

0167]萘乙酸（NAA) 0.04mg/L

0168]琼脂 6.5g/L

0169]白糖 30g/L

0170] pH 值 5.8

0171] 在培养温度为26°C，光照强度为2300Lx，光照时间为9h/d的条件下，增殖培 养23天，每个不定芽新增出增殖芽，最少的一个芽，最多的九个芽，切下新增的高度为 2〜5cm的增殖芽，接种在新的与本步骤相同的增殖培养基中，按本步骤相同的培养条件 继续增殖培养，如此继代培养至获得足够量的增殖芽；

[0172] D、将C步骤的增殖芽按节切成2〜3cm长的茎段，接种在下列继代培养中：

[0173] 3-吲哚丁酸（IBA) 0.1mg/L

[0174]萘乙酸（NAA) 0.3mg/L

[0175]琼脂 6.5g/L

[0176]白糖 30g/L

[0177] pH 值 5.8

[0178] 在与C步骤相同的培养条件下进行壮苗培养，得健壮、带叶的丛生苗；

[0179] E、将D步骤的丛生苗分成单株，接入下列生根培养基中，芽苗过高的，可切下长2〜3cm的苗尖转接至下列生根培养基中，余下的基部返回接种到C步骤的增殖培养 基中，继续进行增殖培养，所述生根培养基为：

[0180] 1/2MS 培养基

[0181]萘乙酸（NAA) 1.0mg/L

[0182]琼脂 7.0g/L

[0183]白糖 30g/L

[0184] pH 值 5.8

[0185] 在培养温度为26°C，光照强度为2300Lx，光照时间为9h/d的条件下，培养18

天，得生根苗；

[0186] F、将E步骤的生根苗在室外散射光下锻炼6天，取苗，用清水洗净苗上培养 基，放入0.1%多菌灵溶液中消毒2分钟，移栽至装有红土：河沙：珍珠岩=1 ： 1 ： 1 质量比基质的育苗袋中，并在基质表面撒上适量腐殖土，按常规浇水、施肥、病虫害防 治管理，成活率达85%以上，当苗长至3〜5cm高，并生出大量须根时，即得到直接种 植在大田中的种植苗。